細胞爬片就是讓玻片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi),細胞在玻片上生長。主要用于組織學(xué),免疫組織化學(xué),冰凍切片,細胞涂片,原位雜交等。
細胞爬片的準(zhǔn)備
1蓋玻片的選擇:
爬片可用一般的蓋玻片,也可用專用細胞爬片(價格比較昂貴)但是細胞貼壁牢固,拍出照片效果好;
2爬片的剪裁:
可根據(jù)自己的需要,到染色時再將之切開,這樣既保證了細胞均一性,又可同時做幾個指標(biāo)的染色剪裁成合適大小,置于6孔板、12孔板或24孔板;
3爬片的使用前處理:
將剪裁好的爬片,置于濃硫酸中浸泡并過夜,第二天先用自來水沖洗20遍,再置于無水酒清中浸泡6小時,再用三蒸水沖洗3遍(個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話,細胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干,備用。烤干后可放入超凈臺中。
4多聚賴氨酸的使用:
很多人都將玻片用此處理,以使細胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸,細胞貼壁仍然很好,且在做后續(xù)的免疫細胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。
細胞爬片的操作
1.胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞于完全培養(yǎng)基中。
2.加細胞前,根據(jù)玻片的大小,先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起,造成雙層細胞貼片。(整個過程注意無菌操作)
3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度接入培養(yǎng)板內(nèi)即可。
4.待細胞貼壁后,可去上清加含藥培養(yǎng)基。
5.按照實驗設(shè)計,作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時間點的實驗的話,將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。
細胞爬片的固定
另外在保存細胞爬片的時候,一般用培養(yǎng)皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實驗時取片。
細胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當(dāng)然,有例外,比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗,因為凋亡的細胞在洗的過程中有可能會脫落。
然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標(biāo)記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個月的片子做免疫組化是沒有問題的。
常用的固定液
1
冷丙酮
——可用于一般的免疫組化染色。
——將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心,丙酮在此溫度不會為固體的)細胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強的揮發(fā)性,注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴,防止其揮發(fā))
——固定10分鐘,取出后,室溫吹干,然后放入-20℃保存。
2
多聚甲醛(常用4%)
——可用于免疫電鏡、免疫熒光以及TUNEL染色。
——主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原,例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等
——室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存
3
95%乙醇
——可用于免疫組化。
——優(yōu)點:穿透性強、抗原性保存較好。缺點:但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時間長,抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。
——室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存
4
甲醛(福爾馬林)
——應(yīng)用廣泛。
——優(yōu)點:形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好,且穿透性強,缺點: 甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果
——室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存。
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