免疫組化原理、流程及結果分析

免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然后用HRP等標記的二抗與一抗進行結合，最后通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在于查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現。
免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態學改變；而后者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。

免疫組化和HE染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜堿性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色，經過一系列復雜的生化反應后，DAB(二氨基聯苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。
常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話，信號不夠強。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力特性，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物，最后DAB顯色。
復合物配制：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物素-過氧化物酶復合物。
2、SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素，但有兩個生物素親和力極高的結合位點，可以與二抗上的生物素結合，敏感性高，復合物不需要使用前混合，更為簡便。
3、PAP法
4、直接法

樣本制備
免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1、必須設陽性對照和陰性對照。
2、 抗原表達必須在特定部位。
3、 陰性結果不能視為抗原不表達。

免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表 
從表可以看出只有6、7實驗結果有意義。1-5均因對照組的結果已否定Ab的特異性或IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗或換用Ab。
染色失敗的幾種情況及原因:
1、所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內。
2、所有切片均呈陽性反應。
3、所有切片背景過深。
4、陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。

所有切片呈陽性反應，其原因:
1、切片在染色過程中抗體過濃，或干片了。
2、緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不徹底。
3、使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應時間過長。
4、抗體溫育的時間過長。
5、H₂O₂濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。

所有切片背景過深，其原因:
1、內源性過氧化酶沒有完全阻斷。
2、切片或涂片過厚。
3、漂洗不夠。
4、底物呈色反應過久。
5、蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
6、使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當。

注意事項：
1、蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
2、切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片。
3、以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應經常配制新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時，切片放傾斜。
⑤抗體孵育后PBS沖洗不充分。
⑥制片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
4、一抗的清洗:
1、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2、溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
3、沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去 結合的物質。
5、PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
2、中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利 于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利 于分解。
6、拍照：
1、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。
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