蛋白酶K的使用方法作用及配制

蛋白酶K是一種從白色念 珠菌分離出來的強(qiáng)力蛋白溶解酶，具有很高 的比活性，是DNA提取的關(guān)鍵試劑。該酶在較廣的pH范圍（4?12.5)內(nèi)及高溫 (50?70°C)均有活性，用于質(zhì)?；蚧蚪M DNA、RNA的分離。在DNA提取中，主要作用是酶解與核酸結(jié)合的組蛋白，使 DNA游離在溶液中，隨后用不同方法進(jìn)行抽提，除去雜質(zhì)，收集DNA。EDTA等螯 合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。蛋白酶K貯存液一般為10mg/ml或20mg/ml。 貯存于一20°C。蛋白酶K溶液為無色透明， 如出現(xiàn)沉淀就不能再使用。
蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。

一、作用：
蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時(shí)間過長或孵育溫度過高時(shí)，都會(huì)對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，導(dǎo)致組織切片的脫落，細(xì)胞核 的消失，從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現(xiàn)的問題，并能達(dá)到理想的染色效果。

蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛，它可以消化包圍靶DNA蛋白，因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)增強(qiáng)雜交信號，但在使用蛋白酶K時(shí)要主要使用的濃度，過高或者過低都會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗(yàn)結(jié)果。

二、保存方法：
保存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月。
孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí)；理想孵育時(shí)間為2小時(shí)。

三、蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)：
20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K)：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

四、蛋白酶K跟蛋白酶有什么區(qū)別：
蛋白酶是所有能夠催化分解蛋白質(zhì)的酶類的統(tǒng)稱,而蛋白酶K則是特指一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶,用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解,比如在提取DNA時(shí)溶解DNA的水中就有一定量的蛋白酶K.所以它們不屬于同一個(gè)產(chǎn)品。

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