蛋白質純化的主要方法及注意事項

蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術。 一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝。為了研究某一個蛋白質，必須首先將該蛋白質從其他蛋白質和非蛋白質分子中純化出來。

一、主要方法
1. 蛋白質的選擇吸附分離（利用顆粒不同程度的顆粒吸附力來使分離的目的達到）。
2. 按照配體特性的分離-親和層析（利用蛋白質分子與另一種稱為配體的分子能夠特異結合這一生物性質）。
3. 低溫有機溶劑沉淀法，使用如甲醇，乙醇等與水可混溶的有機溶劑，降低多數蛋白質的溶解度并且將其析出，和鹽析相比較，這種方法的分辨率更加的高，然而蛋白質比較容易變形，需要在低溫下進行。
4. 按照分子大小不一樣的方法，密度梯度離心（在介質中對蛋白質離心時，蛋白質沉降速度取決于它的質量和密度，質量和密度越大，那么沉降越快；凝膠過濾（一種柱層析）；超過濾（利用蛋白質分子不能從半透膜通過的性質）。
5. 按照溶解度差異分離，等電點沉淀法鹽溶與鹽析（使用一定濃度鹽溶液來使蛋白質的溶解度增大或減小）；（因為在等電點時蛋白質分子的凈電荷為 0，使分子間靜電斥力減少了，所以，聚集沉淀比較容易，這時具有最小的溶解度）。
6. 按照電荷不同的分離方法。主要分為離子交換層析和電泳分離。

二、操作步驟：
1. 所有在純化系統里使用的溶液當日都需要經過 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復至室溫后抽濾脫氣；
2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、緩沖液洗泵；設置流速和柱前警報壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個最大耐受壓力）。防止柱中進入氣泡，影響分離效果；
4. 當柱子限壓在 0.3MPa，或者在限壓狀態下流速很低時，pH valve 中的 Restirtor 可以切換成 Off line，即顯示 By-pass 狀態；
5. 當需要通過儀器上樣環上樣時，將 W1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過注射器倒吸樣品上樣；
6. 進樣閥「Inject」為上樣狀態。上樣結束可將進樣閥切換回「Load」狀態。并用純水認真清洗上樣環至少 3 次；將 W1 閥口處換回原來接頭閥門。
7. 純化結束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統。長期不用，層析柱應保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；
8. 實驗結束后及時傾倒廢液瓶里的廢液；

三、注意事項
1. 為了避免蛋白質變性，不要對樣品劇烈攪動和反復凍融。
2. 緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環。。
3. 為了避免蛋白質的氧化，將 0.1～1 mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或 β-巰基乙醇）加入到緩沖溶液中。
4. 為了避免重金屬對目標蛋白的破壞，將 1～10 mmol/LEDTA 金屬螯合劑加入。
5. 為了避免微生物生長，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質的時候，均必須時刻對它的穩定性注意維護，使它的活性得到保護，需要牢記如下一些通用的注意事項。
6. 盡可能置于冰上或者在冷庫內進行操作。
7. 蛋白濃度不要太稀。
8. 除非是進行聚焦層。否則 pH 需要合適，防止所使用的緩沖溶液 pH 與 pI 相同，使蛋白質的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶抑制劑，避免蛋白酶對目標蛋白的降解；在純化細胞中的蛋白質時，將 DNA 酶加入來使得 DNA 降解，避免 DNA 對蛋白的污染。

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