一、實驗原理
根據Burnet的抗體選擇學說,一個B淋巴細胞只能產生一種針對它能夠識別的特異性抗原決定簇的抗體。從一個祖先B細胞分裂繁殖而形成的純細胞系稱為克隆。來自克隆系的細胞基因是完全相同的,產生的抗體也完全相同。這種從一株克隆系產生的性質相同的均一抗體稱為單克隆抗體。但這種具有分泌功能的B淋巴細胞難以在體外長期存活。
利用細胞融合技術,將上述B淋巴細胞與在體外能長期增殖的骨髓瘤細胞進行融合,經過選擇培養(yǎng)獲取雜交細胞,這種細胞稱為雜交瘤細胞(Hybridoma)。該細胞既有免疫B淋巴細胞分泌特異性mAb的功能,又具有骨髓瘤細胞無限增殖的能力。故應用雜交瘤細胞生產單克隆抗體。
二、儀器設備材料
超凈工作臺、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、倒置生物顯微鏡、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、細胞混勻器、熒光顯微鏡或流式細胞儀等。培養(yǎng)器皿及其它:96孔、24孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、離心管、平皿、保溫杯、培養(yǎng)液過濾裝置、不銹鋼網及手術剪刀、鑷子等。Balb/c小鼠。SP2/0細胞(骨髓瘤細胞)。
三、主要試劑
(1)胎牛血清或小牛血清
(2)培養(yǎng)基:細胞融合常用的培養(yǎng)液有DMEM、RPMI 1640 及無血清培養(yǎng)基等。DMEM有高糖(4500mg/L)及低糖(1000mg/L)之分。雜交瘤細胞在上述幾種培養(yǎng)基中均能良好的生長與增殖
(3)HAT及HT培養(yǎng)液:HAT、HT(sigma)以五十分之一的比例加入培養(yǎng)基( DMEM或RPMI 1640)
(4)聚乙二醇(PEG)溶液:稱取一定量的PEG,高壓蒸汽滅菌(8磅30分鐘),待其冷至50℃左右,與等體積的RPMI1640混合,即為50%的PEG溶液,封口后4℃放置備用。用于細胞融合的PEG的分子量可在1000-6000之間,目前已有商品化的50%PEG溶液(美國 sigma 公司)可直接用于細胞融合
四、實驗步驟
1. DMEM或1640基礎培養(yǎng)基、PEG溶液置于37℃水浴中預溫;
2. 將Balb/c小鼠摘眼球處死后,浸入75%灑精;
3. 無菌取免疫小鼠的脾臟;
4. 脾臟用PBS洗滌后,放入無菌過濾的網篩,再把網篩放在盛有完全培養(yǎng)基的玻璃平皿中用研磨棒(或注射器針管)輕輕研磨或擠壓,使其通過網篩;
5. 將培養(yǎng)皿中的細胞懸液吸出,放入離心管中,1200rpm/min,離心5min;
6. 收集2×10^7個生長良好的SP2/0細胞,與1×10^8個脾臟細胞混合于透明塑料離心管中;
7. 用RPMI1640洗滌混合細胞兩遍,1000rpm離心8min后,棄盡上清并用手指彈擊管底,使兩種細胞充分混勻成糊狀;
8. 將塑料管置于37℃保溫杯中,吸取1ml經37℃預溫的50%的PEG溶液,將吸管輕輕插入細胞底部,在1min內勻速加完,且邊加邊輕輕攪拌;
9. 在水浴中靜置90s,再加入40ml 37℃預溫的DMEM基礎培養(yǎng)基,室溫靜止5min后離心(1000rpm×10min),棄去上清;
10. 將沉淀細胞輕輕用40ml含1%HAT、15%FCS的DMEM培養(yǎng)懸浮?;靹蚝蟮渭釉谏鲜龊凶甜B(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中,100µl/孔,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
11. 3~4d后半量換液,10d后改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng),2周后轉用含15%FCS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
12. 培養(yǎng)結束后,顯微鏡觀察融合細胞。
五、注意事項
1、整個制備過程需嚴格無菌及溫度控制。
2、細胞傳代培養(yǎng)時注意適時更換培養(yǎng)液。
3、SP2/0細胞與脾細胞比例需嚴格控制,這決定了融合率。
4、融合細胞因細胞膜受損而特別脆弱,操作過程需溫和小心。
5、融合劑PEG的加入時間需準確把握,避免融合失敗。
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