細胞融合實驗操作流程

實驗準備：

飼養細胞：

融合前一天，取符合免疫質控標準的Balb/c小鼠，脫頸處死并泡在75%酒精中消毒。

用手術剪刀輕輕剪開老鼠的腹部皮膚。（注意請勿破壞小鼠的腹膜）

取10mL DMEM培養基在50mL無菌離心管中， 5mL注射器吸取3~5mL培養基，用手術鑷子提起小鼠腹膜，將5ml培養基打入老鼠腹部，反復吹打3-4次后將培養基回收，置于50ml無菌離心管中。再次吸取5ml培養基，重復此步驟。

在無菌條件下取出小鼠脾臟，用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網制成單個脾細胞懸液，再與腹腔細胞懸液混合，低速離心（1000rpm*10min），棄上清。

使用HAT培養基重懸，制成飼養細胞懸液，可按照105/孔使用，均勻鋪96孔板，每孔100μL。（在制備過程中嚴格保證無菌）



SP2/0準備：

SP2/0細胞在融合前4—5天復蘇，培養換液，使細胞在融合前狀態良好且處于對數增長期。

試劑準備：

取1mL/管50% PEG1450一支，DMEM，FBS-DMEM，FBS-DMEM(HAT)等試劑，均預熱置37℃

實驗流程：

SP2/0收集：

SP2/0低速離心（1000rpm*5min），棄上清，用DMEM復懸清洗，再重復一次此步驟，37℃復懸備用。

脾細胞懸液制備：

取免疫完成的小鼠，眼球取血后，浸潤在75%的酒精中消毒滅菌。在無菌條件下取出其脾臟，使用研磨器研磨脾臟，與DMEM混合過篩網制成單個脾細胞懸液，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，用DMEM清洗并再一次重復此步驟，37℃復懸備用。

細胞融合：

將脾細胞和SP2/0按照[脾細胞：SP2/0 = 2:1~3:1]的比例，混合于50ml離心管中低速離心（1000rpm*10min），棄上清且確保管內無液體殘留，將細胞團塊輕輕敲散，使脾細胞 & SP2/0在管底均勻混合鋪開。加入預熱完成的50% PEG1450 ，在1min內逐滴均勻加入，加完后37℃反應1min，反應完成后加入10~15ml左右終止液（DMEM）終止反應，由慢至快逐步滴加，10min全部加入完成。

融合鋪板：

細胞融合完成后，低速離心（1000rpm*10min），棄上清，使用FBS-DMEM(HAT)復懸細胞制成細胞懸液，（過程中注意動作輕柔，不可用力吹打，以免破壞融合細胞降低融合率）。將提前一天已加入飼養細胞的細胞培養板取出，用吸頭將板內培養基上清全部吸出丟棄，將剛制備完成的細胞懸液加入96孔培養板中，每孔200μL，轉入5% CO2恒溫培養箱中培養觀察。

融合換液：

融合細胞在FBS-DMEM(HAT)中培養3~7天，根據細胞融合情況，將培養上清吸出丟棄，更換成FBS-DMEM(HT)，每孔200μL。換液后觀察細胞形態，根據細胞生長情況，在4~7天后用Elisa進行融合陽性篩選檢測。

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