通過免疫共沉淀確定未知結合蛋白
該實驗的思路為:先通過免疫共沉淀實驗,得到結合蛋白,隨后對得到的結合蛋白進行測序。
用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中;
將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中,在微量離心機上4℃以最大速度離心15min;
收集上清(約30 ml)并加入30 μg的適當抗體,4℃搖動免疫沉淀物1 h;
加入0.9 ml的瓊脂糖蛋白A懸液,4℃搖動免疫沉淀物30 min;
用含900 mmol/L NaCl的NETN洗瓊脂糖蛋白A混合物,再重復洗5次。最后,用NETN洗一次;
吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4min;
將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中,在10mA的恒定電流下電泳過夜;
通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質泳帶;
從膠上切下目標帶,將其放到微量離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min;
用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質,再進行電洗脫;
通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽進行Edman降解測序。
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