免疫共沉淀實驗流程

通過免疫共沉淀確定未知結合蛋白

該實驗的思路為：先通過免疫共沉淀實驗，得到結合蛋白，隨后對得到的結合蛋白進行測序。

用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；

將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15min；

收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h；

加入0.9 ml的瓊脂糖蛋白A懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min；

用含900 mmol/L NaCl的NETN洗瓊脂糖蛋白A混合物，再重復洗5次。最后，用NETN洗一次；

吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4min；

將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10mA的恒定電流下電泳過夜；

通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質泳帶；

從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；

用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再進行電洗脫；

通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽進行Edman降解測序。

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