PCR技術的常規實驗流程步驟

PCR（聚合酶鏈式反應）是一種分子生物學技術，現在已經被廣泛運用于臨床和實驗室，用于擴增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細胞內DNA復制的條件，最終完成特定基因的體外復制。PCR實驗基本由變性、退火、延伸三個步驟完成。

1.變性。變性的目的是使模板DNA雙鏈解旋成為單鏈以便與引物結合，通常給它加溫至95℃（這是Taq酶進行30個左右的循環后活力不致受到過多損失時能耐受的最高溫度）。模板的完全變性對PCR成功與否至關重要，第一輪循環中變性時間往往為10min，然而根據經驗，在其他各次的循環中一般以95℃持續30s（變性時間過長會損害酶活性）足以使各種模板完全變性。當模板的G+C含量超過55%時則需要更高的變性溫度，可以選用來源于古細菌的DNA聚合酶，因為它比Taq酶更能耐受高溫。

2.退火。模板變性成單鏈后，溫度快速降至退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補序列可發生結合。退火溫度的選擇也至關重要，如果退火溫度太高，那么引物就無法與模板很好地結合，進而就會影響擴增效率；如果退火溫度太低，引物則會產生非特異性結合，從而導致非特異性DNA片段的擴增。退火30-60s便可使引物與模板之間完全結合。

3.延伸。模板-引物結合物在Taq酶的作用下，沿著5’→3’的方向合成一條與模板DNA鏈互補的鏈。延伸時的溫度通常為72℃（Taq酶的最適溫度為72℃-78℃）。在最適溫度下，Taq酶的聚合速率約為2000bp/min。不過靶基因的每1000bp的擴增產物的延伸時間的設計時長為1min。另外，延伸時間隨擴增片段長短而定，甚至在所擴增目的基因的長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略。

重復循環“變性→退火→延伸”過程就可獲得更多的半保留復制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。大多數PCR含25-40循環，過多易產生非特異擴增。在最后一個循環后，反應在72℃維持5-10min可使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。

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