免疫共沉淀（CoIP）實驗注意事項

CoIP是在IP實驗的基礎上進行的擴展，主要用于蛋白之間的互作研究。常被用于鑒定特定蛋白復合物中已知或未知的蛋白組分。其原理是基于抗體與抗原（靶蛋白）之間的特異性結合，此時如果樣品溶液中存在能與靶蛋白相互作用的目的蛋白，會一同被拉下來，隨后利用SDS-PAGE，Western Blot等方法對得到的目標蛋白進行分析，進而證明兩者間的相互作用。

CoIP可行性注意事項：

1.可能難以檢測到低親和力和瞬間結合的蛋白質相互作用。

2.需要在實驗前已知能與A蛋白結合的目的蛋白B是什么，才能選擇合適的抗體保證用A蛋白抗體沉淀下來的蛋白復合物中能檢測到B。如果不確定與A結合的蛋白是什么，或者有多種蛋白與A結合時，可通過質譜對沉淀產物進行后續鑒定來獲取未知蛋白質的種類。

3.單純的實驗結果陽性并不能直接證明兩種蛋白之間存在直接結合作用，也可能存在其他蛋白在其中充當了橋梁。因此需要設計更完善的實驗方案，并進行正向與反向驗證，最終證明這一結果。

CoIP實驗注意事項：

1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（Np40或Triton x-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定；

2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用；

3）使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 ， 兔多克隆抗體：正常兔IgG；

4）確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生；

5）要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；

6）確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。