細胞實驗注意事項

1、細胞復蘇

1. 將細胞凍存管從干冰中取出，立即放置37°水浴速融1min，見無冰晶即可不再水浴（用鑷子拿取）
2. 將細胞凍存液加入10~15ml完培中，吹打混勻，減少DMSO對細胞毒性，800rpm離心5min
3. 棄上清，細胞沉淀進行下一步傳代。

2、細胞傳代

試劑與材料（貼壁細胞）：

細胞：4T1乳腺癌細胞；基礎培養基：1640培養基（含有生物素、 維生素 B12、對氨基苯甲酸PABA、高濃度的維生素肌醇和膽堿；不含有蛋白質、脂質或生長因子）；血清：胎牛血清FBS（細胞營養液：提供基本營養物質、提供激素和各種生長因子、提供結合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷、對培養中的細胞起到某些保護作用）；胰酶（消化貼壁細胞促附著蛋白如層黏連蛋白、纖維連接蛋白等）

實驗方法：

1）試劑解凍：胰酶，培養基在37°水浴加熱解凍

2）制備完全培養基：1640培養基中加入10%的血清，水平搖勻，避免震搖引起泡沫

3）細胞消化：將原來培養基倒除，用500μl首選pbs/胰酶先潤洗（消化培養基里的蛋白，避免對細胞生長產生影響），去除胰酶，再沿壁（不直接加到細胞表面）加入1ml胰酶，在37°中消化3~5min（可1min左右觀察消化情況）。

4）細胞傳代：加入3ml完培，輕柔吹打，取1/4的消化后的細胞（其余的倒掉）加至EP管，在細胞離心機上離心1000rpm 5min，離心后的細胞，輕柔放置，防止細胞混散，可傾倒除去胰酶液（留一點點液體保持細胞活性）快速加入培養基。以10CM培養皿為例：先在皿中加入7ml的培養基。在EP管中懸空加入1~2ml左右培養基（60MM皿3ml培養基；10CM皿10ml培養基），輕柔的吹打，可以沿壁混合，使黏附細胞變成單細胞；將細胞液加入至皿中，劃10次8字使皿充分被浸潤，放置37°孵育。

5）注意事項：

1. 在進行細胞實驗前，需紫外照射生物柜30min，穿戴整齊后方可進入細胞房。
2. 胰酶和培養基需37°水浴加熱，至適合細胞生存溫度。
3. 開始實驗前，關閉紫外照射，打開風櫥和燈光。
4. 開始實驗時，需要手消且所需物品需要消毒，才可放入生物柜中，臺面用酒精棉球消毒
5. 物品擺放整齊，留出空間實驗，右手用的在右手，左手用的在左手，切勿交叉。瓶蓋用前可擰松，開口朝上或立放。每用完槍頭盒，需蓋蓋，且切勿雙手經過槍頭盒。實驗室，槍桿不要伸入瓶中或管中。
6. 實驗結束，所用試劑需標簽；清理垃圾和廢液；帶走自己的東西；關閉燈光和通風櫥。
7. 下一次傳代前，顯微鏡中觀察細胞生長情況，密度70%~80%左右，即可傳代。

試劑與材料（懸浮細胞）

thp-1（人急性白血病單核細胞）——顯微鏡觀察時，晃動皿，細胞游動；1640培養基，25培養瓶，10CM培養皿，45mlEP管

實驗方法

1. 轉移培養皿中的細胞至45mlEP管，移液槍吹打（沿壁吹打，使之變成單個細胞）
2. 1000rpm，離心5min ，得到細胞沉淀
3. 快速傾倒上清液（沿細胞堆積的另一邊），保留500μl左右的液體
4. 細胞沉淀加入4ml培養基（反復吹打），培養皿中加入7ml培養基（共10ml），25培養瓶中加入4ml培養基（共5ml）
5. 重懸后細胞液分別移至培養皿和培養瓶中，輕微搖晃，放置37°恒溫箱