PCR 成功的四大要素及注意事項

一、模板
1. 模板降解
1）盡量選擇新鮮提取的模板進行 PCR 擴增，通過凝膠電泳檢測模板的完整性，若降解嚴重需要重新制備模板；
2）模板避免反復凍融。

2. 模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制劑
1）采用離心柱法提取核酸，純化模板，消除抑制劑的干擾；
2）適當減少模板量，采用梯度稀釋摸索最佳模板量；
3）選用抗逆性強的 DNA 聚合酶。

3. 模板量太低
1）適當增加模板量；
2）模板為 cDNA 時，選用目的基因表達量高的組織提取高質量 RNA 并選用基因克隆專用的反轉錄試劑盒得到的 cDNA 作為模板；
3）選用靈敏度高的 DNA 聚合酶。

4. 高 GC, 復雜模板
1）使用 PCR 添加劑（比如 DMSO，甜菜堿）或 GC enhancer，促進高 GC，復雜序列模板雙鏈解離從而有利于引物退火和序列延伸；
2）增加變性時間或溫度，使 DNA 雙鏈徹底解離；
3）選用適用于高 GC，復雜模板擴增的 DNA 聚合酶。

5. 長片段
1）確保模板的完整性；
2）選擇適用于長片段擴增的 Taq DNA 聚合酶或者超強高保真 DNA 聚合酶；
3）在試劑盒說明書建議的延伸速度基礎上適當延長延伸時間；
4）采用抑制熱交錯 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。

二、引物
1. 引物降解
1）重新合成高質量引物，少量分裝保存，防止多次凍融，避免長期置于冰箱冷藏部分。

2. 引物設計不合理
1）建議使用引物設計軟件（比如 Primer premier 6, Oligo 7 等）設計并選取評分較高的引物；
2）確保引物和模板結合的特異性。

三、DNA 聚合酶及其他反應組分
1. DNA 聚合酶選擇不合適
1）根據實驗目的選擇合適的 DNA 聚合酶，比如分子克隆實驗中涉及到序列的高保真擴增，需要選擇一款針對不同類型序列具有普適性的高保真酶。

2. DNA 聚合酶活力下降
1）檢查試劑是否過期，按照說明書要求合理保存試劑。

3. 反應緩沖液體系與目的基因不匹配
1）不同目的 PCR 反應要求反應緩沖液中的鎂離子、鉀離子、銨離子、化學添加劑等成分濃度是不一樣的，建議使用試劑盒中優化好的緩沖液體系。

四、反應條件
1. 退火溫度不合適，影響引物與模板特異結合
1）使用引物設計軟件建議的退火溫度，退火溫度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃；
2）不同的試劑鹽離子濃度不同，最佳的退火溫度可能存在差異，建議以軟件建議退火溫度為中心設置溫度梯度，來獲得最佳退火溫度；
3）設置降落 PCR（Step-down）反應程序。

2. 其他反應條件不合適
1）不同的 DNA 聚合酶試劑最佳反應條件是有差別的，選用試劑說明書建議的變性溫度和時間，退火時間，延伸溫度和速度，循環數。