1、固相載體選擇
聚苯乙烯:具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能,抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。
聚氯乙烯:聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。
2、包被
①板孔的選擇:ELISA級別的微孔板
②抗體選擇:選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體,根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索最適濃度
③包被緩沖液:pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液
④包被溫度:2-8 ℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h
⑤包被濃度:包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。
3、封閉
①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)
②選擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)級BSA、Tween等)
4、加樣及孵育
①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。
②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件,建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀,推薦軌道直徑3mm,轉(zhuǎn)速在500±50rpm;
③檢測抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說明書提示;
④洗板對于ELISA來說,是極其關(guān)鍵的一步,保證ELISA的特異性
⑤封板膜一定要一次一換,切勿二次甚至多次使用,以防交叉污染
5、顯色和終止
①使用前需檢查,底物在加入96孔板之前應(yīng)為無色透明
②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用,避免污染
③孵育時(shí)間,說明書上為參考范圍,但具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索。
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